隧道納米管（TNTs）是一種納米級的、富含肌動蛋白的、用于細胞間通訊的瞬時細胞間管。結構的復雜性和空間組織所涉及的組成部分的TNTs仍然未知。在本次研究中，STORM超分辨率成像技術被運用到結構組織的微絲和微管在細胞間的TNT在納米尺度上。作者的研究結果揭示了不同的分布的微絲和交織結構的微管在TNT，促進TNT通信。

研究背景

細胞-細胞通信是通過多種機制發(fā)生的關鍵細胞活動，例如突觸、間隙連接、突觸橋和隧道納米管（TNT）。在過去十年中，科學研究人員描述了TNTs在許多細胞類型中的重要生物學功能。此外，最近的研究還強調(diào)了TNTs在一些疾病中的重要作用，如神經(jīng)退行性疾病、癌癥診斷、免疫學和病毒學。雖然發(fā)現(xiàn)TNT參與關鍵的生物學和病理學過程，但TNT的結構復雜性在很大程度上仍然未知。揭示TNT相關成分的空間組織可以促進對其細胞功能以及如何調(diào)節(jié)疾病的了解。超分辨率技術超越了衍射極限，使可視化的細胞結構在前所未有的空間分辨率。在這些技術中，基于單分子定位的隨機光學重建顯微鏡（STORM）由于其出色的空間分辨率和簡單的操作而在生物學研究中具有廣泛的應用。在這里，作者報告的直接觀察TNTs依靠在納米尺度上的STORM成像技術。超分辨率成像用于不同TNT中微管的不同結構和分布的可視化，并利用三維（3D）STORM成像探索TNT中微管的空間組織。此外，線粒體分布和TNT形態(tài)之間的潛在關系進行了進一步研究，這是有助于闡明線粒體在TNT的交付模式。STORM技術的這種一般方法為進一步研究TNT開辟了無數(shù)的可能性。

研究結果（部分）

如上所述，TNT是一種類型的肌動蛋白支持的細胞突起，其在不同大小范圍內(nèi)具有不同類型。為了更好地理解不同類型的TNT之間的差異，作者利用STORM技術在BS-C-1細胞中以不同的視野對不同大小的TNT中的微抗體進行成像，如圖1所示，在STORM成像中采用10分鐘的透化時間以記錄TNT中的微物質(zhì)。

圖1 不同視野下BS-C-1細胞間TNT中微絲的超分辨率成像

(A-C)微絲的代表性全視場寬視場圖像（左）和加框區(qū)域的放大圖像（右）。(D-F)方框區(qū)域的相應STORM圖像（左）。放大的圖像（中間）顯示了微絲的詳細分布。紅線顯示STORM圖像的放大圖片中箭頭指向區(qū)域的橫截面輪廓（右側(cè)）的高斯擬合。接下來，作者測量了來自亮視圖圖像的TNT的寬度，并將結果與共焦圖像中最外面的微陣列之間的間隙進行比較（圖1B）。作者發(fā)現(xiàn)，TNTs的寬度通常略大于相應的微陣列的間隙。這一結果表明，微量元素傾向于定位在TNT管腔的兩側(cè)。然后，作者應用STORM成像來可視化TNT中微物質(zhì)的詳細分布。圖中的STORM超分辨率圖像中，圖1D-F顯示了TNT中更清晰的微污染物分布。此外，很明顯，隨著最外微構件差距增大（從0.09mm到1.17mm，圖1B），最外微構件的間隙增大（從0.09mm到1.17mm）。如圖1D-F所示，在TNT中存在更多的微孔，并且在TNT的中空部分中出現(xiàn)更薄和更直的微孔?？傊?，這些結果表明，隨著TNT的尺寸變大，其中的微泡數(shù)量增加，表明細胞通訊之間的膜附著不同。微管作為另一種重要的細胞骨架成分，存在于納米管的胞質(zhì)通道中，并構成了致密的TNT網(wǎng)絡。作者采用STORM成像以不同的視野觀察BS-C-1細胞的TNT中微管的組織（圖1）。通過抗α-微管蛋白單克隆抗體和Alexa Fluor? 647偶聯(lián)的第二抗體實現(xiàn)微管的染色。作者觀察到TNT中的微管蛋白，如圖1B所示。圖2A-C也顯示了細胞間的喇叭狀連接。作者發(fā)現(xiàn)微管在TNT中的分布明顯地組織起來，如圖所示。圖2A-C。微管的分布寬度在0.29 ~ 4.58mm之間。當TNT變寬時，會出現(xiàn)更多的微管，其中一些微管以交織的方式沿著管壁延伸。

圖2 STORM超分辨率成像顯示微管在不同細胞中的不同分布

代表性的寬視場圖像和每張圖片中緊挨著寬視場圖像的對應STORM圖像指示具有不同直徑的TNT中微管的各種組織模式。(A-C)BS-C-1細胞中TNT微管在不同視野中的超分辨率成像。放大圖像顯示詳細信息。(D-F)三種類型癌細胞中TNT微管的超分辨率成像：食管癌細胞KYSE 150（D）、宮頸癌細胞HeLa（E）和人骨肉瘤細胞U2 OS（F）。除了BS-C-1細胞外，作者還對各種癌細胞中的細胞間微管進行了成像，包括食管癌細胞KYSE 150、宮頸癌細胞HeLa和人骨肉瘤細胞U2 OS，這些細胞通常用于研究實驗室中的生理和病理過程。總之，上述結果說明了不同細胞中TNT中微管的不同組織模式。為了詳細研究微管的組織模式，必須通過3D成像來觀察它們。如上所述，微管傾向于在TNT中纏結。為了更清楚地了解微管在TNT中如何扭曲，進一步應用3D-STORM成像來分析微管的詳細組織。超分辨率圖像顯示，在較小直徑的TNT中，至少有三個微管相互纏繞（圖3A），并且更多的微管也在具有較大直徑的TNT中顯示出纏結組織（圖3A、3B），沿著更高分辨率的STORM圖像和直觀的3D成像結果，超分辨率圖像顯示這些微管以有序的螺旋纏繞方式纏繞在一起。

圖3 分別具有較?。ˋ）和較大（B）直徑的TNT中微管的3D超分辨率成像

為了更好地理解通過TNT的線粒體轉(zhuǎn)移，作者在這里使用STORM成像來研究TNT內(nèi)線粒體的空間分布。我們首先觀察了線粒體在兩個相鄰細胞之間的分布，并在明亮的視圖圖像中觀察到兩個細胞之間明顯的管狀結構，如圖所示，線粒體傾向于分布在靠近細胞兩側(cè)的區(qū)域，而在TNT的中間區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)明顯的線粒體。然后，我們應用雙色成像觀察微管和線粒體在TNT同時使用顯微鏡。共定位圖像顯示大部分線粒體集中在TNT中細胞的芽狀側(cè)上，這與圖1B中所示的STORM結果一致。

圖4 明視圖、寬視野和STORM圖像

研究小結

綜上所述，作者應用STORM超分辨成像方法來探索TNT組分在納米尺度的結構和分布。微管和微管的不同組織模式說明了TNT形成的不同結構模式、STORM成像從直觀方面呈現(xiàn)了TNT中微管的清晰交織結構。此外，在TNTs中觀察到明顯的線粒體分布，表明TNTs在細胞間具有運輸功能。作者的數(shù)據(jù)提供了一個新的框架，未來的研究TNT的形態(tài)和結構。隨著超分辨成像技術和標記方法的快速發(fā)展，作者肯定了TNTs結構與功能之間的相關性將在未來得到快速驗證。