為了在血管功能中作為血流的機械傳感器和作為經(jīng)血管交換的屏障發(fā)揮不同的作用，內(nèi)皮表面糖萼（ESG）應該具有有組織的結構。由于光學和電子顯微鏡的局限性，直到最近發(fā)展的超分辨光學顯微鏡STORM才揭示了ESG的超微結構。實驗結果表明：HA是一種長鏈分子，編織成網(wǎng)狀覆蓋在內(nèi)皮細胞表面.相比之下，HS是垂直于細胞表面的較短分子。HA和HS在內(nèi)皮管腔表面彼此部分重疊。研究者還定量了內(nèi)皮表面頂部、中部和底部區(qū)域的HS的長度、直徑、方向和密度。

#01導言

排列在我們血管系統(tǒng)中的內(nèi)皮細胞（EC）的腔表面包被有由蛋白聚糖和糖胺聚糖（GAG）組成的膜結合大分子的糖萼。由于其獨特的位置，在循環(huán)血液和血管壁的界面處，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ESG在維持正常血管功能方面起重要作用。因此，自20世紀60年代以來，通過各種方法對其組成、結構和機械性能進行了廣泛的研究。然而，由于空間分辨率的限制或樣品制備過程中的人為因素，靜電陀螺儀的空間化學組織仍然不清楚。最近開發(fā)的隨機光學重建顯微鏡（STORM）是三種類型的單分子定位顯微鏡之一，采用有機染料和熒光蛋白作為光可切換發(fā)射器，以將時間分辨率轉(zhuǎn)換為超空間分辨率，這比傳統(tǒng)的顯微鏡高一個數(shù)量級。STORM和其他類型的超分辨率光學顯微鏡能夠在納米尺度上發(fā)現(xiàn)和研究細胞結構，從單個蛋白質(zhì)到天然細胞環(huán)境中的整個細胞器。ESG的作用基于其分子組成和組織。ESG的組成部分已在中進行了深入研究。ESG主要由帶有短酸性寡糖和末端唾液酸（SA）的糖蛋白和蛋白聚糖（PG）如硫酸乙酰肝素PG（HSPG）（包括具有長糖胺聚糖（GAG）側鏈的多配體聚糖和磷脂酰肌醇聚糖核心蛋白）組成。帶負電荷的GAG結合蛋白質(zhì)、生長因子、陽離子和其他血漿組分。血管EC中的主要GAG是硫酸乙酰肝素（HS）、硫酸軟骨素（CS）和透明質(zhì)酸（HA）。在這三者中，最豐富的是HS，占總GAG的50-90%，其余由CS、HA和SA組成。HS和CS與PG共價結合，而HA不與PG核心蛋白結合。HA是一種非硫酸化GAG，其與其表面受體CD 44和HA介導的運動性受體（RHAMM）結合。除了其生化組成外，ESG的厚度和超微結構決定了其功能。通過電子顯微鏡（EM）對ESG的第一次可視化使用陽離子染料釕紅，其結合酸性粘多糖并在四氧化鋨存在下產(chǎn)生電子密度。隨后的研究使用金膠體和免疫過氧化物酶標記。Adamson和Clough然后使用大的帶電標記蛋白（無法穿透ESG），陽離子化鐵蛋白（分子量≈ 450 kDa）證明，在不存在血漿蛋白的情況下，ESG會崩潰，可能是由于消除了與血漿蛋白的分子內(nèi)相互作用，并且其未受干擾的厚度比釕紅觀察到的20 nm大幾倍。所有這些方法都可能遭受與水性固定劑相關的脫水假象，水性固定劑可能溶解除蛋白聚糖的蛋白質(zhì)核心之外的所有蛋白質(zhì)，并破壞固有的水合結構。研究人員開發(fā)了一種使用碳氟化合物作為四氧化鋨的非水載體來保存水溶性結構的方法，該方法被應用于微血管，以消除其中的一些限制。Rostgaard和Qvortrup對碳氟化合物-戊二醛固定方法的進一步闡述揭示了毛細血管壁上的絲狀刷狀表面涂層，但層厚度小于50 nm，表明更表面的基質(zhì)結構裂解。所有前述EM研究揭示具有小于IOOnm的厚度的ESG。最近研究者發(fā)現(xiàn)大鼠左心室心肌毛細血管上的ESG厚度為0.2-0.5 μm?；铙w光學顯微鏡的差的空間分辨率限制了ESG厚度的準確測量。因此，通過采用激光掃描共聚焦顯微鏡和多光子顯微鏡，以及針對HS或HA結合蛋白或麥胚凝集素的熒光標記抗體來標記ESG的主要組分，已經(jīng)開發(fā)了新的成像方法。這些新方法的應用揭示了大血管中厚得多的ESG：在小鼠頸總動脈中為4.3-4.5 μ π ι ，在小鼠頸內(nèi)動脈中為2.2 μ π ι ，在頸外動脈中為2.5 μ π ι 。Ebong等人首次展示了體外靜電陀螺儀的冷凍電鏡圖像，該圖像避免了常規(guī)電鏡的脫水偽影，并觀察到厚度大于5 μm（最大可達11 μm）的結構。最近，使用高靈敏度和分辨率共聚焦顯微鏡和原位/體內(nèi)單微血管和離體主動脈免疫染色，Yen等人揭示了大鼠腸系膜和小鼠提睪肌毛細血管和毛細血管后小靜脈上ESG的厚度為1-1.5 μm。大鼠和小鼠主動脈的ESG厚度為2-2.5 μ m。Betteridge等人通過比較在體內(nèi)單個微血管中質(zhì)膜標記和麥胚凝集素（WGA）標記ESG（SA殘基）之間的距離，發(fā)現(xiàn)與Yen等人相同類型的微血管中ESG厚度為0.17-3.02 μm，這取決于標記和分析方法。ESG的超微結構組織及其與細胞骨架組分的關系（使用電子斷層掃描進行3D重建得到證實。通過他們的EM方法觀察到的ESG的厚度為? 100nm，類似于先前在青蛙腸系膜微血管上發(fā)現(xiàn)的厚度?？朔撍ぜ谛屡d市場和傳統(tǒng)的空間分辨率的限制,在目前的研究中,通過使用STORM,研究者發(fā)現(xiàn)第一次超限分辨圖像ofHS和HA組件的環(huán)境、社會和治理在支架表面培養(yǎng)bEnd3老鼠大腦微血管內(nèi)皮細胞單層,并量化ultra-structural參數(shù)ofHS和直徑HA在EC支架表面的不同區(qū)域。

#02實驗方法

2.1樣品制備

細胞培養(yǎng)：小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞（bEnd 3），來自ATCC（Manassas，VA）在Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基/營養(yǎng)混合物F-12 Ham培養(yǎng)基中培養(yǎng)。（DMEM/F-12）、2 mM L-谷氨酰胺和100 U/mL青霉素和1 mg/mL鏈霉素（均來自Sigma-Aldrich，St. Louis，MO），補充有10%胎牛血清，并在37 °C下在具有5%C02的潮濕氣氛中孵育。免疫熒光染色：將bEnd 3細胞胰蛋白酶化并以600個細胞/mm 2的密度接種在50 yg/mL纖連蛋白包被的1.5號玻璃底培養(yǎng)皿上并培養(yǎng)3-4天直至匯合。然后用1%BSA/PBS輕輕洗滌細胞，用2%多聚甲醛和0.1%戊二醛固定20分鐘，用0.1%NaBH4還原7分鐘，用1%BSA/PBS洗滌3次，并用2%正常山羊血清（NGS）封閉30分鐘。對于HS染色，將固定的細胞與小鼠抗硫酸乙酰肝素10 e4在4 ℃孵育過夜，然后與ATTO 488綴合的山羊抗小鼠IgG孵育;對于HA染色，將固定的細胞與生物素化的透明質(zhì)酸結合蛋白在4 °C孵育過夜，然后與Alexa Fluor 647綴合的抗生素孵育。最后，將樣品用2%多聚甲醛和0.1%戊二醛后固定10分鐘，然后保持在1%BSA/PBS中。

2.2STORM圖像采集

使用STORM對樣品進行成像。使用由405 nm波長激光以交替照明激活的ATTO 488和Alexa Fluor 647的多個報告物來獲取HS和HA的3D圖像?；诿總€報告子以19 ms/幀的捕獲速度捕獲的40，000個ofEM-CCD圖像，獲得細胞頂端（腔）表面上的三個256 × 256（40 × 40 μm2）的HS和HA視野，位于頂部、中部和底部。頂部區(qū)域聚焦于細胞核上方的細胞表面，底部區(qū)域聚焦于兩個相鄰細胞的谷，中間區(qū)域聚焦于頂部和底部區(qū)域中間的平面。閃爍點的原始圖像電影由伴隨STORM系統(tǒng)的分析軟件處理，并在圖1中展示。

2.3數(shù)據(jù)分析

應用單發(fā)射器質(zhì)心算法來估計數(shù)據(jù)電影中激活的熒光團的3D位置，并產(chǎn)生3D STORM圖像，其空間分辨率分別為側向平面中的20nm和軸向方向上的50nm。通過使用混合高斯模型從STORM圖像估計細胞表面上的組分中的地面實況熒光團位置。然后，在估計的熒光團位置的基礎上估計組件的超微結構參數(shù)。對于HS元件，我們假設它是一個圓柱體，其等效直徑具有與真實的形狀相同的橫截面積（橢圓狀）。其他超微結構參數(shù)、長度、HS的取向和相鄰HS元件之間的距離（中心到中心）在圖2的插圖中定義。由于難以識別在細胞腔表面處編織成網(wǎng)絡的單個HA元件，我們從圖3中所示的HA區(qū)段的2D圖像估計HA直徑。

#03研究結果

3.1HS和HA的組織

圖1A-C展示了STORM揭示的HS和HA的組織。圖1A是在頂部區(qū)域觀察到的，圖1B是在中間區(qū)域觀察到的，圖1C是在細胞腔（頂端）表面的底部區(qū)域觀察到的。對于所有圖，第二列是HS圖像（綠色），第三列是HA圖像（紅色），第一列是第二列和第三列的疊加。第一行是2D頂視圖，第二行是34 μm × 34 μm視場的3D視圖。第三和第四行是第一行中具有綠色虛線的區(qū)域的放大的2D和3D視圖。第五和第六行是來自第三行中具有藍色虛線的區(qū)域的進一步放大的2D和3D視圖。第二列和第三列中三維視圖左側的顏色條表示長度比例。從這些圖中可以看出，HA（紅色）是編織成2D網(wǎng)絡片的長分子，其覆蓋細胞腔表面并且與細胞腔表面在同一平面中。相比之下，HS是垂直于細胞腔表面的較短分子。HS和HA在細胞腔表面部分重疊。

3.2HS超微結構參數(shù)和HA直徑

圖1 STORM揭示的ESG成分和超微結構

HS和HA在單元(A),在細胞細胞底部中間(B)和(C)從細胞腔的表面。所有的插圖,第二列是HS圖像(綠色),第三列是HA圖像(紅色)和第一列是第二和第三列的疊加。第一行是2 d頂視圖,第二行是3 d視圖的字段～34μm×34μm。第三和第四行放大2 d和3 d視圖從該地區(qū)綠色虛線的第一行。第五和第六行進一步擴大2 d和3 d視圖從該地區(qū)的藍色虛線第三行。左邊的顏色條的3 d視圖HS(第二列)和HA(第三列)代表深度(長度)。

表1 bEnd3細胞腔表面HS超微結構的定量

表2 在bEnd3細胞腔表面的HA直徑

表2總結了HA直徑估計從2 d圖像圖3所示。直徑是185.3±44.7 nm, 155.5±57.2 nm,和156.9±56.1 nm,分別在頂部、中部和底部區(qū)域的細胞腔的表面。這在HA直徑?jīng)]有顯著差異這三個地區(qū)(p > 0.1)。比較HA直徑與HS直徑?jīng)]有區(qū)別哈哈直徑和HS直徑頂部和底部區(qū)域(p > 0.2),但在中部地區(qū)有顯著差異(p < 0.01)。

#04討論

使用STORM，研究者揭示了在納米尺度的bEnd 3單層的ESG中HS和HA的空間化學組織。直接和間接證據(jù)表明，ESG在維持血管功能方面至少發(fā)揮三種重要作用。

1)它可以作為EC的機械傳感器和換能器來感知血流；

2）它通過形成分子篩維持正常的微血管通透性，允許水和小分子通過但限制血漿蛋白等大分子;

3）它在循環(huán)紅細胞（RBC）和形成血管壁的EC之間產(chǎn)生潤滑緩沖液以避免RBC損傷，并產(chǎn)生屏障以防止循環(huán)白細胞、血小板和腫瘤細胞粘附到血管壁。它還屏蔽EC表面受體，防止其超活化。

STORM揭示的ESG中HS和HA的組織和分布為ESG扮演這三個角色提供了直接的結構可行性。HS元件垂直于細胞腔表面，能夠感測血流并用作EC的機械傳感器和換能器。在細胞腔表面的底部處的更密集的HS分布（其可以覆蓋細胞間連接）沿著由HA形成的編織網(wǎng)絡有利于ESG成為用于經(jīng)血管交換的分子篩、循環(huán)細胞和形成血管壁的內(nèi)皮細胞粘附的屏障以及EC表面受體的屏障。